BMC Infectious Diseases

НАУЧНА СТАТИЯ

Пробиотици Streptococcus salivarius 24SMB и Streptococcus oralis 89a възпрепятстват образуването на патогенни биофилми на горните дихателни пътища (ГДП)

Alessandro Bidossi , Roberta De Grandi , Marco Toscano , Marta Bottagisio , Elena De Vecchi , Matteo Gelardi and Lorenzo Drago

Резюме

Предистория: Инфекциите на ушите, параназалните синуси, носа и гърлото са много чести и представляват сериозен проблем за здравната система. Бактериалните биофилми са свързани с инфекции на ГДП и антибиотична резистентност, което поражда сериозни опасения относно терапевтичното управление на такива инфекции. В този контекст, новите стратегии, способни да се борят с биофилмите, могат да бъдат терапевтично полезни и да предлагат валидна алтернатива на конвенционалните антимикробни средства. Биофилмите се състоят от смесени микробни общности, които взаимодействат с други заобикалящи (обграждащи) видове и комуникират чрез сигнални молекули. Тези взаимодействия могат да доведат до антагонистични ефекти, които могат да бъдат използвани в борбата срещу инфекциите във вид на „бактериална терапия”. Streptococcus salivarius и Streptococcus oralis са α-хемолитични стрептококи, изолирани от човешкия фаринкс на здрави индивиди. Няколко проучвания при деца с отит, показват, че тяхното интраназално приложение е безопасно и добре понасяно, и е в състояние да намали риска от остър среден отит. Целта на това изследване е да се направи оценка на S. salivarius 24SMB и S. oralis 89a за способността им да увреждат биофилма на типичните патогени на ГДП.
Методи: За да се изследва дали разтворимите вещества, отделени от двата стрептокока, могат да забавят развитието на биофилма на избраните патогенни щамове, са направени (помощни) ко-култури с използване на Transwell® вложки . Произведени са също и биофилми от смесени видове, за да се прецени дали забавянето на образуването на биофилм може да изисква директен контакт. Производството на биофилма се изследва чрез спектрофотометричен анализ и чрез конфокална лазерна сканираща микроскопия.
Резултати: Наблюдавахме, че S. salivarius 24SMB и S. oralis 89а са способни да забавят способността за формиране на биофилм на избрани патогени и дори да разсеят/разпръснат своите предварително формирани биофилми. Дифузионните молекули, секретирани от двата стрептокока и пониженото рН на средата, показват, че са включени в механизмите на анти-биофилмната активност
Заключения: S.salivarius 24SMB и S. oralis 89a притежават желани характеристики като пробиотик за лечение и профилактика на Инфекции на ГДП. Въпреки това, естеството на инхибирането изглежда многофакторно и са необходими допълнителни изследвания, за да се получат по-нататъшни прозрения.
Ключови думи: Biofilm, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Probiotics, Respiratory tract infections

Предистория

Въпреки наличието на механични бариери и имунната защита на гостоприемника, ГДП предлагат лесен достъп на патогени, участващи в остри и хронични инфекции на ушите, параназалните синуси, носа и гърлото. Повечето от инфекциите на ГДП (URTIs) обикновено са леки и причинени от вируси; обаче, инфекциите на ГДП могат също да бъдат представени от бактерии, представляващи клинично предизвикателство, свързано с по-висока заболеваемост и хронично развитие на заболяването [1]. Освен това, инфекциите на ГДП се свързват с наличието на микробен биофилм, който води до хронични инфекции, характеризиращи се с ремитиращ курс и резистентност към медицинско лечение [2,3]. Биофилмът се определя като „структурирана общност от микроорганизми, обвити в самостоятелно произведена полимерна матрица, прилепнала към инертна или жива повърхност” [4]. След като биофилмът е установен, инфекцията става все по-трудна за премахване, тъй като микробите, пребиваващи в матрицата, са защитени от имунната система на гостоприемника и антибиотиците [5]. Следователно, микробният биофилм прави инфекциите продължителни и по-упорити за лечение.
Биофилмите обикновено се състоят от смесени микробни общности, способни да взаимодействат с други заобикалящи видове и да комуникират чрез сигнални молекули [6]. Тези междувидови взаимодействия могат да доведат до взаимни или антагонистични ефекти [7,8]. Значимостта на нормалната микробиота в защитата срещу инфекции на ГДП е широко доказана. Въпреки това, дисбалансът във физиологичния състав на флората може да доведе до колонизация и инфекция на мукозата чрез опортюнистични патогени.
Например, забелязано е, че децата, страдащи от отит, се характеризират със значително по-малък брой α-хемолитични стрептококи в тяхната назофарингеална флора в сравнение с тези, които не са свързани с отита [9, 10], което дава възможността за прилагане на живи микроорганизми като пробиотици да предоставят ползи за здравето на гостоприемника [11]. В действителност, използването на бактериални видове, получени от здрава микробиота в устата като пробиотик за лечение на инфекции на ГДП, е предложено като валидна алтернатива на антибиотиците, допринасяйки за възстановяването на балансираната флора, докато рециклира или предотвратява адхезия и колонизация на потенциални патогени.
Известно е, че алфа-хемолитичните стрептококи (т.е. Streptococcus salivarius и Streptococcus oralis), изолирани от човешкия фаринкс, са ранни колонизатори на горните респираторни лигавици и тяхното числено преобладаване е предпоставка за здрава флора [12, 13]. Освен това, тези видове притежават желани характеристики, като производство на бактериоцин Colicin V и бактериоциноподобни пептиди [14,15], и двата действат като основополагащ колонизатор. Въпреки това, S. salivarius и S. oralis притежават висок афинитет към човешката лигавица, като предпазват епителните клетки от прилепване на патогени, интернализация и потенциални цитотоксични ефекти. Поради тази причина тези α-хемолитични стрептококи представляват преобладаващия вид в горната част на дихателната система и те могат да влияят селективно върху състава на микробиозата [16-19]. През последните десетилетия няколко проучвания демонстрираха интраназално приложение на S. salivarius и S. oralis като безопасна и добре поносима стратегия за намаляване на риска от нови епизоди на остър среден отит при децата, страдащи от отит и намаляване количеството на течности на средното ухо при деца със секретивен отит [19-23].
В това проучване ние тествахме хипотезата, че S. salivarius 24SMB и S. oralis 89а, и двете изолирани от търговски продукт (Rinogermina®, DMG Italia Srl, Pomezia, Италия), са в състояние да взаимодействат с образуването на биофилм in vitro и да изкоренят предварително формирани биофилми от типични патогени на горните дихателни пътища, такива като Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes. В допълнение се правят хипотези за механизмите, лежащи в основата на активността на антибиофилма на пробиотичните стрептококи.

Методи

Бактериални щамове и клетъчна среда за отглеждане
Клинично значими патогени на горните дихателни пътища са изолирани от пациенти с инфекции на ГДП в Лабораторията по Клинична химия и микробиология на IRCCS Институт Galeazzi, където те са били редовно събирани и съхранявани. По-специално, били са избирани щамове на S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes, S. pneumoniae, M. catarrhalis и P. acnes, произвеждащи биофилми. Идентификацията на изолатите е извършена с помощта на Vitek2 Compact (BioMerieux, Marcy L’Etoile, Франция) и допълнително потвърдена от пиросеквениране (PSQ96RA, Diatech, Jesi, Италия), както е описано на друго място [24]. Получаването на биофилм е било оценено с помощта на спектрофотометричен анализ, описан от Christensen et al. [25]. S. salivarius 24SMB и S. oralis 89а са изолирани от произведения продукт и са идентифицирани чрез биохимични анализи и пиросеквениране, както е описано по-горе. Всички щамове се съхраняват при -80°С в подходящи бульони, обогатени с 10% глицерол (VWR Chemicals, Leuven, Belgium) до тестването им. Brain Heart Infusion broth (BHI, bioMerieux, Marci L’Etoile, France) се използва за култивиране на стафилококи, BHI плюс 5% от дефибринирана кръв (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Италия) за стрептококи и M. catarrhalis, и тиогликолатен бульон (TH, Oxoid, Rodano, Италия) за P. acnes.
При извършване на експерименти с индиректни и смесени видове (виж по-долу), S. oralis и S. salivarius бяха отгледани в същата среда, необходима за тествания патогенен щам. Преди началото на изследването, способността за образуване на биофилм на S. salivarius 24SMB и S. oralis 89а се оценява във всяка от гореспоменатите среди за отглеждане, като не се откриват значими разлики между тях (данните не са показани).

Взаимодействие между S. salivarius 24SMB и S. oralis 89a
За да се прецени дали взаимодействието между S. salivarius 24SMB и S. oralis 89а, инхибира производство на собствени биофилми, са направени ко-култури с помощта на Transwell® вложки (микропорести PET мембрани с диаметър на порите 0.4 µm, 1.6х106 пори/см2), предназначени за 24-ямкови плаки (Falcon®, Corning, New York, NY, USA), както е описано на друго място [26]. Ямките бяха инокулирани със суспензия от 800 µL S. salivarius 24SMB. Суспензия от 200 µL S. oralis 89a, бяха разпределени в горното отделение на Transwell® вложките и обратно. След това, бяха получени смесени двойни биофилми чрез инокулиране на 1 mL смес от двата пробиотични щама. Във всички гореспоменати експериментални условия, S. salivarius и S. oralis бяха култивирани в съотношение 98:2 (около 1.5 х 107 CFU/mL от S. salivarius и 3 х 105 CFU/mL S.oralis), като това на получения продукт. От всеки щам се получават моно-видови биофилми като положителни контроли, докато само средата е използвана като негативна контрола. Експериментът е извършен трикратно. Щамовете се инкубират в подходящи условия при 37°С и след 72 часа е отчетено образуването на биофилм.